好文荐读：荧光探针检测帕金森病模型中过氧化氢含量变化

本文来源：JIOHS

本文介绍的是南京工业大学吴琼副教授、李林教授课题组关于荧光探针检测帕金森病模型中 H₂O₂ 含量变化的研究工作，发表在《Journal of Innovative Optical Health Sciences》期刊上。

A novel fuorogenic probe for visualizing the hydrogen peroxide in Parkinson's disease models
Gaobin Zhang, Zheng Li, Fangjie Chen, Duoteng Zhang, Wenhui Ji, Zhengpeng Yang, Qiong Wu*, Chengwu Zhang, Lin Li* and Wei Huang
https://doi.org/10.1142/S1793545820500133

研究背景

帕金森病（Parkinson's disease, PD）是一种常见的老年病，主要表现为运动功能障碍，严重影响病人及其家庭的生活质量。虽然研究人员付出了巨大的努力，但是目前仍然缺乏有效的治疗手段。近年来，随着研究的不断深入，人们发现对 PD 的早期诊断和早期干预能够显著的延缓发病期，减轻发病程度。因此，开发高效、快速和廉价的疾病分析测试手段具有重要实际应用价值。

目前，PD 的发病机理尚不明确，但根据大量的文献报道，氧化应激产生过多的活性氧是 PD 发生的原因之一。H₂O₂ 是活性氧的一种，基于成像技术的荧光探针在复杂生物环境检测中具有操作简便、高选择性和灵敏性等诸多优点，开发高效的 H₂O₂ 荧光探针，对复杂生物环境中 H₂O₂ 的实时监测，有望实现对 PD 的早期预警。

内容简介

本文设计合成了一种新型 H₂O₂ 荧光探针，具有高选择性和灵敏性，能够检测复杂生物体内如细胞、斑马鱼和线虫等 PD 模型中 H₂O₂ 含量的变化，具备诊断早期帕金森病的潜在应用价值。

图文导读

探针设计

Scheme 1. (a) The design and synthesis route of the probe CBH; (b) Overall detection strategy by using probe CBH. The probe was used for bioimaging of H₂O₂ in vitro, in living HeLa cells, zebrafish and C.elegans.

本文设计合成了具有高度选择性的荧光探针。利用与 H₂O₂ 发生特异性氧化还原反应的苯硼酸酯作为反应基团，经简单的有机合成反应，得到发光很弱的荧光探针分子 CBH。探针 CBH 与 H₂O₂ 发生特异性反应后，被氧化为酚，经消去和成环过程，转化为具有优异发光性能的荧光染料分子，通过荧光信号“开-关”实现对 H₂O₂ 的检测。此探针可应用于细胞、斑马鱼和线虫 PD 模型中的 H₂O₂ 成像，研究 H₂O₂ 含量与PD的关系，达到检测疾病的目的。

荧光响应

Fig 1. (a) Fluorescence spectra of CBH in PBS buffer solution in the presence of H₂O₂at different concentrations. (b) Time-dependent fluorescence intensity of CBH upon addition of 10 equiv. H₂O₂ in PBS buffer solution.

本文首先研究了探针 CBH 对 H₂O₂ 的荧光响应性能。随着 H₂O₂ 的加入，探针 CBH 在 PBS 缓冲液中的荧光强度显著增强。加入 60 倍当量的 H₂O₂ 后荧光强度增强 12 倍，检测限低至 0.72 μM。该探针对 H₂O₂ 的响应速度较快（30 min 内），表明其对 H₂O₂ 具有很好的响应性能。

选择性与竞争性

Fig 2. (a) The fluorescence response of CBH in PBS buffer solution to various analytes. (b) The effect of various analytes on the fluorescence response of CBH in PBS buffer solution. 

在实际应用中，探针的工作环境复杂，对 H₂O₂ 的响应是否具有专一性和优先性，是否受其他物质的干扰，是考察探针 CBH 性能的关键指标。本文选择 47 种在复杂生物环境中常见的金属离子、阴离子、氨基酸、活性氧（ROS）和 RNS 作为参照，通过选择性和竞争性实验，考察了探针对 H₂O₂ 响应的专一性。实验结果表明，仅在 H₂O₂ 存在的条件下，反应液荧光显著增强，且不受其他物质的干扰，证明探针 CBH 对 H₂O₂ 具有高选择性；而在以上 47 种溶液中加入相同含量的 H₂O₂ 后，反应液荧光均出现明显提高，表明在复杂环境中，探针会优先与 H₂O₂ 反应，排除了其他物质的干扰和竞争，证明探针 CBH 可用于复杂生物环境中 H₂O₂ 的检测。

细胞中外源性 H₂O₂ 检测

Fig 3. Confocal fluorescence microscopy imaging of live HeLa cells pre-treated with CBH and different concentrations of H₂O₂ for 30 min at 37 °C. Scale bar represents 20 μm.

体外实验结果表明，探针 CBH 对 H₂O₂ 具有优异的响应性能。为考察探针在复杂生物体内的响应情况，本文研究了探针 CBH 对 HeLa 细胞中 H₂O₂ 的响应。由细胞毒性实验结果可知，CBH 毒性低、生物相容性好，能够透过细胞膜进入细胞。因为细胞中本身存在一定浓度的 H₂O₂，经共聚焦荧光显微镜观察证实，在 HeLa 细胞中，探针 CBH 呈现微弱荧光。加入外源性 H₂O₂ 后，细胞呈现的荧光强度明显提高，表明探针可以检测细胞中的 H₂O₂。

细胞中内源性 H₂O₂ 检测

Fig 4. Confocal images of HeLa cells incubated with CBH for 30 min with pretreatment of Rot and NAC. Scale bar represents 20 μm.

内源性 H₂O₂ 的产生与疾病密切相关。Rotenone（Rot）是一种 ROS 诱导剂，能够使细胞发生氧化应激，产生过量的 H₂O₂。如图 4 所示，细胞经过 Rot 处理后加入探针 CBH 孵育，细胞显示明亮的荧光；进一步在Rot诱导的细胞中加入 H₂O₂ 清除剂 N-Acetylcysteine（NAC）后，再加入探针 CBH 孵育，细胞荧光强度明显减弱，证明探针可用于检测细胞内由于氧化应激产生的 H₂O₂。

斑马鱼模型中 H₂O₂ 检测

Fig 5. (a) Confocal images of zebrafish (5-day-old) with CBH for 30 min and incubated with H₂O₂ or pretreated with NAC. (b) Relative fluorescence intensities of imaging.

利用斑马鱼模型进一步研究探针 CBH 的测试性能。如图 5 所示，探针 CBH 检测到斑马鱼体内含有少量 H₂O₂，表现出微弱荧光；加入外源性 H₂O₂ 后，斑马鱼腹部及全身呈现明亮的荧光；加入 H₂O₂ 清除剂 NAC 后，测试组与对照组相似，均无明显荧光信号，说明探针 CBH 可实现对斑马鱼内源性 H₂O₂ 和外源性 H₂O₂ 含量的检测。

PD 线虫模型中 H₂O₂ 检测

Fig 6. Fluorescence imaging of N2 worms, normal VC1024 worms and VC1024 worms cultured with NAC, then incubated with CBH for 30 min at 37 °C.

秀丽隐杆线虫是第一个完成全基因组测序的模式生物，其体内约有 42% 的基因与人类疾病存在相关性，拥有简单但完整的多巴胺神经系统，可用于构建帕金森病模型。本文选用野生型 N2 和 PD 模型 VC1024 线虫，分别加入探针 CBH 进行孵育。结果发现，N2线虫无明显荧光信号产生，VC1024 线虫产生明亮的荧光；探针 CBH 检测经 NAC 预处理的 VC1024 线虫时，荧光信号微弱，说明 CBH 能够正确区分正常线虫和 PD 模型线虫，具有用于帕金森病诊断的潜力。

作者简介

吴琼，女，副教授，硕士生导师。2012年博士毕业于韩国梨花女子大学，并随后在梨花女子大学纳米化学部从事生物光电子传感方向博士后锻炼。2013年加入南京工业大学先进材料研究院继续博士后工作（导师：黄维院士），2019年晋升副教授。以柔性光电子材料的发光/导电等性能为主要依据，从事功能性光电子纳米复合材料的设计、制备，结合电化学、化学发光等技术，拓展基于电化学、化学发光技术的柔性生物传感器制备与应用。精准获取生物体内复杂体系的组成信息，用作疾病检测，建立新型临床检测方法。例如线粒体相关疾病的早期诊断（动脉粥样硬化、帕金森）等发病前的微量/痕量标志物测定。获得国家自然科学基金青年基金、中国教育部留学回国人员科研启动基金等项目的支持，发表包括第一作者及通讯作者在内的相关SCI论文30余篇，申请国家发明专利6项，授权4项。

李林，男，教授，博导。2009年博士毕业后，于新加坡国立大学化学系（YAO ShaoQ.教授课题组）从事化学生物学相关的博士后研究工作；2014年全职回国加入南京工业大学先进材料研究院黄维院士团队；2015年任先进材料研究院生物电子所副所长，院长助理；2017年任副院长至今。课题组主要关注合成小分子生物功能调节的生物医学光子学研究，涵盖生物光子学/有机化学/药物化学/蛋白质工程，专注线粒体特异性的病理学生物体系显影新方法在早期诊疗和转化新药开发中的应用。研究成果在活体层面上分别揭示了小分子荧光探针在检测和调控蛋白质活性中的作用，同时在基因水平上阐述了该类合成小分子生物功能调节剂在疾病诊断，信号转导和药物开发等生物医学领域巨大的应用前景。迄今为止，在Nature Communications，Accounts of Chemical Research，Journal of the American Chemical Society，Angewandte Chemie International Edition等期刊上累计发表SCI收录论文170余篇，申请/授权专利40/8项，参与编撰专著《分子影像与精准诊断》一本。2014年当选江苏特聘教授，2015年入选国家青年千人计划；主持国家自然科学基金面上和青年项目各一项，江苏省自然科学基金杰出青年基金和青年项目各一项；当选“中国青年化学家元素周期表Mc元素”代言人，“中国生物医学工程学会生物医学光子学分会”青年委员，“中国环境诱变剂学会活性氧生物学效应专业委员会”青年委员，新加坡神经医学研究院（NNI）客座研究员, 《材料导报》编委，《中国临床药理学与治疗学》青年编委，江苏省侨联青年委员会第三届委员会常务委员。

期刊简介

《Journal of Innovative Optical Health Science》(JIOHS)期刊由教育部主管，华中科技大学主办，新加坡世界科学出版社和华中科技大学《创新光学健康科学杂志（英文）》编辑部共同出版。该刊主编为海南大学校长、华中科技大学武汉光电国家研究中心主任骆清铭院士。JIOHS期刊已被SCI、Ei、Scoups等数据库收录，且为开放获取（OA）期刊。该刊曾入选2018年中国科技期刊影响力提升计划D项目。

JIOHS期刊的办刊宗旨为刊载生物医学光子学领域的新理论、新进展、新成果，促进国内外学术交流，推动光子学技术在生物医学领域的研究应用，提高我国在该领域的科研水平和国际影响力。内容包括：光子治疗学和诊断学、光学临床运用技术与系统、组织光学、激光生物组织相互作用和组织工程学、生物医学光谱学、高级显微和成像技术、纳米生物光子学和光学分子成像、多模式混合生物医学成像、微纳加工和医学微系统。

更多期刊详情可见：

http://www.worldscientific.com/worldscinet/jiohs

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