【Analytical Chemistry】分离获取细胞外囊泡（EVs）用于肺恶性GGO的液体活检

2019 年 10 月 12 日 外泌体之家

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随着胸部低剂量CT筛查的普及，越来越多的肺磨玻璃结节（GGO）被发现。肺GGO可分为单纯磨玻璃影（pure ground glass opacity, pGGO）和混合性磨玻璃影（mixed ground glass opacity, mGGO）两种类型，其中约有50%以上的GGO为早期肺腺癌。若能早期诊断，及时手术治疗，患者的5年生存率可达95%-100%。若进展到I期肺癌，患者5年生存率则迅速下降到50%不到。目前，临床诊断主要仍基于影像学特征来判断GGO良恶性。这往往需要病人定期、反复地接受CT检查，监测病灶的形态、大小、进展等情况。由此，从GGO发现到确诊为肺腺癌可能需要数月，甚至数年。在经济和医疗资源都造成沉重负担。虽然组织活检可以被用于鉴别诊断，但由于GGO直径较小、形态可能不规则，实质部分分布不均匀，肿瘤异质性，所处位置不利于穿刺等诸多情况，使得组织活检面临很大难度。总之，目前尚无快速、准确的分子诊断方法用于恶性GGO的早期诊断，其相关技术因此也亟待开发。

细胞外囊泡（EVs）能够被包括免疫细胞、血小板、树突状细胞、神经元和上皮细胞等几乎所有类型的细胞分泌，并且广泛存在于包各种体液中。肿瘤来源的EVs在引起肿瘤转移、塑造适合肿瘤转移的条件及帮助肿瘤逃避免疫监视等方面都发挥重要作用，且与正常细胞相比，肿瘤细胞来源的EVs所含有的脂质、蛋白质、RNA和DNA等其种类、数量等有一定的差异，部分EVs可能还含有肿瘤特异性的物质，这些都可作为液体活检的检测物。肿瘤细胞来源的EVs有望成为肿瘤诊断、病情监测、疗效评估的新型生物标志物，作为新型的肿瘤诊断标志物，具有极其重要的研究和应用价值。近年来的研究证实，EV来源的DNA可用于非小细胞肺癌（NSCLC）的诊断及治疗监测，且发现在I/II期NSCLC中，EV DNA的诊断特异性和灵敏度高于血浆里的循环游离DNA（cfDNA）。研究者推测其原因在于，EV DNA被完全包裹在EV内，避免了核酸酶的降解，保证了EV DNA片段的完整性，其长度可以超过50 kbp。最新研究还证明了，活细胞也可以释放包裹有dsDNA，ssDNA，mtDNA的EV，尽管相关机制还不明了。相比而言，cfDNA则是从凋亡或坏死的细胞中释放的，且遭受酶降解，导致其片段长度一般在100-300 bp，关键突变信息可能在降解过程中丢失。因此，EV DNA相较于cfDNA在肿瘤早期诊断中更有价值。与晚期肺癌患者相比，恶性GGO患者外周血中的EV数量与常人无异。若收集被严重降解的cfDNA用于恶性GGO的诊断，有极大的假阴性风险。而被磷脂双分子层保护的相对完整EV DNA则可以克服该缺点。为论证EV DNA是否可以用于恶性GGO的分子诊断，来自南京医科大学附属无锡人民医院胸外科毛文君、郑明峰课题组，美国宾厄姆顿大学万源教授课题组，及上海浦美生物医学研究所的研究人员合作开发了一种能快速有效分离、回收外周血中EV的新技术。并结合二代测序分析、对比了8名GGO患者的组织DNA和EV DNA。相关研究结论发表在Analytical Chemistry杂志上。

该技术利用逐层组装技术，将肝素及聚二烯丙基二甲基氯化铵（PolyDADMAC）包裹到聚苯乙烯小球表面。利用肝素与EV表面硫酸类肝素蛋白聚酶（HSPG）的特异性结合，来快速高效分离EV。由于肝素带有强烈负电荷，其能有效阻止cfDNA，cfRNA，以及绝大部分的带负电荷的血清蛋白的非特异性吸附，从而确保EV的纯度。该方法能在1小时内可分离血浆中约81%的EV，同时能去除约99.5%的血浆蛋白和核酸污染物。分离完成后，仅需要1M的盐溶液处理5分钟，即可将72%的EV完整地从小球表面释放下来，供后续的EV核酸、蛋白提取、分析，甚至还可以完成EV的细胞功能性实验。随后的临床样本论证实验中，纳入了8例单发GGO患者，包括7例原位腺癌和1例微浸润腺癌，从2ml血浆中分离EVs，并采集了术后组织样本。对每个患者的EV DNA和组织DNA进行全外显子测序。对比组织DNA和EV DNA测序结果发现，基因突变一致性为39.8%，其中EGFR、TP53和NF1较其他致癌或抑癌基因检出率和突变率更高，与肺腺癌密切相关。在吸烟与非吸烟患者中，基因突变的比例和构成存在明显差异。微浸润腺癌患者的EV DNA和组织DNA中，其突变数目增加趋势一致，且明显多于原位腺癌患者。

简而言之，该方法能有效分离、回收EV，供后续的分子分析，为EV相关研究提供了可靠、方便、可行的分离方案。处理2ml血浆或血清样本材料成本也仅需几十元。结合高灵敏度、高通量的测序平台，可有助于肺恶性GGO，及其他肿瘤的快速诊断和治疗监测。

参考文献：

Wan Y, et al. Rapid Isolation of extracellular vesicles via lipid-based nanoprobes. Nat Biomed Eng. 2017 1(4):0058
Wan Y, et al. Nanoscale extracellular vesicle-derived DNA is superior to circulating cell-free DNA for mutation detection in early-stage non-small-cell lung cancer. Ann Oncol. 2018 29(12):2379-2383
Mao W, et al. Isolation and Retrieval of Extracellular Vesicles for Liquid Biopsy of Malignant Ground-Glass Opacity. Anal Chem. 2019 Oct 9. doi:10.1021/acs. analchem. 9b03064. [Epub ahead of print] PubMed PMID:31596073.