《Science Advances》Highlights重磅！应用赛特SE-iFISH揭秘乳腺癌转移机制

乳腺癌是国内外女性发病率最高的恶性肿瘤，让无数女性闻之色变。乳腺癌可防可治，早期乳腺癌10年生存率达80%。虽然早期乳腺癌患者的生存率不断提高，但仍有20-30%的I-III期患者最终会发生肿瘤远端转移，进展为晚期肿瘤。晚期乳腺癌患者的5年生存率低于25%，因此，揭示肿瘤转移的机制，对于进一步提高乳腺癌及其它肿瘤的诊疗效果具有极其重要的意义。

最近，由上海交通大学附属上海第一人民医院肿瘤中心、德国Ludwig Maximilians 大学医学中心和赛特生物经过长期密切合作，在大量临床样本及肿瘤动物模型的基础上，使用多种技术手段（包括血液CTCs/骨髓DTCs分离与培养；相关肿瘤细胞系及肿瘤动物模型的建立；SE-iFISH CTCs/DTCs检测；CTCs/DTCs单细胞全基因组扩增与NGS测序等），对乳腺癌转移机制进行了长期深入研究，并获得重大发现。在乳腺癌患者体内精确锁定了肿瘤远端转移过程中起主导作用的肿瘤细胞 – EpCAM⁺小细胞异倍体CTCs与DTCs (≤白细胞)。该项研究成果已刚刚发表在国际顶级的《科学》杂志子刊《科学·进展》(Science Advances, AAAS) (影响因子IF=12.804)。肿瘤中心王红霞主任医师为通讯作者，德国慕尼黑大学Olivier Gires为共同通讯作者。刘啸和李军建为共同第一作者。这篇文章同时被选为本期杂志的亮点文章(Highlight)。

在该杂志将此重大发现向全球11000多名相关记者发布的同时，我们也在第一时间向国内广大肿瘤界同行简要介绍该项重要研究成果。

本文要点

• 本研究基于大量乳腺癌肿瘤动物模型及临床标本，锁定了乳腺癌远端转移过程中起主要作用的肿瘤细胞亚类：EpCAM⁺异倍体小细胞CTCs与DTCs。此类乳腺癌细胞与使用SE-iFISH确定的肝癌患者术后复发过程中起主导作用的CTCs亚类细胞相一致 (Wang et al., 2018 Cancer Lett 412:99)

  
  

• 应用SE-iFISH检测乳腺癌患者外周血中EpCAM⁺异倍体小细胞CTCs ，可有效评估肿瘤远端转移，而EpCAM⁺二倍体CTCs 与肿瘤转移无明显相关性

  
  

• 乳腺癌患者骨髓中检出EpCAM⁺异倍体小细胞DTCs可准确预测患者6个月的较差预后。如果EpCAM⁺异倍体小细胞DTCs占DTCs总数 ≥20%，患者的总生存率明显降低

  
  

• iFISH CTCs单细胞全基因组扩增及NGS测序显示，与EpCAM^- CTCs相比，EpCAM⁺异倍体CTCs表现出了多个基因扩增，涵盖了tight junction、有丝分裂细胞周期、 乳腺上皮细胞分化、乳腺导管形态发生等，提示乳腺癌患者EpCAM⁺ CTCs的细胞粘附、增殖、上皮分化能力增加

  
  

• 使用依赖EpCAM的方法检测CTCs，会严重漏检CTCs总数 (如耐药CTCs等)，但有可能检出与转移相关的CTCs

 

肿瘤转移过程中的“渐变EMT”及相应细胞类别

肿瘤细胞在肿瘤转移过程中经历“渐变EMT (gradual EMT)”，此过程中细胞表面EMT标识物的表型也随之不断变化，形成不同类别的肿瘤细胞：包括上皮型(E)、上皮型为主/间质混合型 (E/m)、间质型为主/上皮混合型 (M/e)及间质型 (M)。M型的肿瘤细胞浸润血管(intravasation)能力最强，进入血液后即为CTCs。CTCs可在特定器官(如肺、肝脏、骨髓等)穿出血管(extravasation)，形成播散性肿瘤细胞(disseminated tumor cells, DTCs)，并进一步形成肿瘤转移灶。

 

本文研究人员首先使用4T1乳腺癌细胞借助同源移植技术，建立了4T1小鼠肿瘤动物模型。从肿瘤模型中分离出血液CTCs及骨髓DTCs，经过细胞培养后形成相应的细胞系CTC1 及 DTC1。进一步的蛋白表达(免疫组化、流式细胞仪)及mRNA检测发现，与上皮型(E) 4T1细胞相比，CTC1为间质型(M)，表达Vimentin 与CK，但却丢失了所有上皮表型蛋白EpCAM及E-Cadherin；而DTC1 为混合型(E/m)，含有大量上皮型(E)及少量间质型(m) 肿瘤细胞。

 

不同EMT蛋白表型的肿瘤细胞成瘤能力检测

一系列肿瘤细胞成瘤能力(tumorigenic abilities) 实验证明，CTC1细胞具有最强的生长(3D-colony)、迁移(migration)及浸润(invasion)能力，而DTC1具有与血管内皮细胞最强的粘附(adhesion)能力。相比4T1细胞而言，CTC1与DTC1的生长、迁移及浸润能力均有较大增加。

 

作者将培养后的DTC1细胞接种BALB/C鼠，成瘤后经富集、培养分别获得了26株DTC1 衍生的CTCs亚细胞系(sublines)和10株DTCs亚细胞系。这些亚细胞系涵盖了EMT所有表型，包括E, E/m, M/e及M。成瘤能力实验证实，E/m表型的CTCs 亚细胞系，无论是与血管内皮细胞的粘附能力，还是浸润能力均高于M/e 表型的肿瘤细胞。

 

E/m型CTCs具有最高的肿瘤转移能力

为了确定EMT中哪类细胞具有最高的肿瘤转移能力，作者将上述E, E/m, M/e和M型细胞接种于Balb/c鼠，19天后计数肺转移灶数目。结果显示，与间质型(M/e, M) CTCs相比，上皮型(E, E/m) CTCs具有更高的转移指数 (metastatic index/cell)，其中E/m 型CTCs具有最高的转移指数。

 

SE-i·FISH^®  检测乳腺癌患者血中CTCs及骨髓中DTCs

为了进一步验证上述在肿瘤动物模型中得到的“EpCAM⁺ CTCs及DTCs具有较高转移能力”的实验结论，作者使用SE-iFISH技术，对34例确诊为乳腺癌转移的病人进行了血液CTCs、骨髓DTCs及相应细胞团的染色体核型与EpCAM蛋白表型的同步原位检测。结果显示，骨髓中的DTCs细胞团数目明显高于血中的CTCs细胞团。

染色体核型、EpCAM蛋白表型、细胞形态三位一体分析CTCs与DTCs

为了对CTCs与DTCs 进行全面分析，以确定患者体内具有特定临床意义(如与肿瘤转移相关)的亚类细胞，作者使用SE-iFISH技术，从细胞内生物链(cellular bio-chain)角度，对所有从患者体内检测出的CTCs及DTCs进行了全面系统性分析。

鉴于细胞内生物链三要素“DNA-mRNA-蛋白质”中的mRNA属于不稳定的中间过渡性产物，不像蛋白质那样具备直接调节细胞的功能，且DNA扩增或mRNA阳性因受“翻译”与“转录”等调控点的调节，未必导致相应蛋白的阳性表达(Luoh, et al., 2013 Springerplus 2:386)。因此，作者选择了早已被广为接受的针对肿瘤细胞的染色体数目异常和EpCAM的蛋白表达进行检测，而mRNA 不在考量范围之内。

结果显示：1） 乳腺癌转移患者外周血中EpCAM⁺ CTCs检出率为41.2%，占CTC细胞总数的 22.4%；骨髓中EpCAM⁺ DTCs的患者阳性检出率为64.7%，占DTC细胞总数的 65.9%；2）病人CTCs多为间质型，而DTCs 多为上皮型；3）CTCs中8号染色体三倍体及 ≥5 倍体的细胞占多数，分别为36.6% 及30.4%，而DTCs中占多数的分别是四倍体(36.3%) 及三倍体(28.6%)；4）无论CTCs 还是DTCs，小细胞(≤白细胞)均占大多数，分别为62.13% 和95.89%。此结果也再次证实了采用细胞孔径过滤去除白细胞以试图分离肿瘤细胞的方法具有很大的局限性。

 

i·FISH CTC单细胞NGS测序

 

为了比较EpCAM⁺与EpCAM^- CTCs在基因水平的异同，作者利用“非激光单细胞分离系统 NMSCM”对来自3个肿瘤患者的10个EpCAM⁺ CTCs及20个EpCAM^- CTCs分别进行了单细胞挑取、全基因组扩增、建库及二代测序。测序数据结果分析显示，与患者各自的白细胞相比，两类细胞存在657个扩增或缺失的CNV差异，覆盖了1255个编码基因(coding genes)。其中，EpCAM⁺ CTCs扩增的基因涉及tight junction (CLDN3, STRN, PTPN13)、有丝分裂细胞周期(CCNB1, SHB, EIF4EBP1, DUSP3, ABL1)、 乳腺上皮细胞分化(ERBB4)、乳腺导管形态发生(GLI2, CSF1R)等方面，进一步提示肿瘤患者EpCAM⁺ CTCs的细胞粘附、增殖、上皮分化能力增加。

SE-i·FISH^®  检测出的不同蛋白表型CTCs与DTCs亚类细胞的临床意义

作者对SE-iFISH 检测出的不同蛋白表型的异倍体CTCs和DTCs在乳腺癌病人中的临床意义做了深入研究， 发现EpCAM⁺ CTCs 、DTCs在各自总数中所占比例与患者肿瘤远端转移密切相关(M1)，尤其是EpCAM⁺ DTCs相关性更大。EpCAM⁺ DTCs所占比例可以较准确预测乳腺癌转移患者的总生存率(OS) ，以ROC曲线分析得到cut-off值为20%，骨髓中EpCAM⁺ DTCs在DTCs总数中的比例≥20%， 患者总生存率显著下降。

结 论

1. 根据本研究实验结果，乳腺癌转移的主要机理(包括参与的主要细胞及途径)为：肿瘤细胞自原发灶脱落，经EMT及血管内渗作用后入血形成CTCs。一部分CTCs到达骨髓形成具有很强转移能力的EpCAM⁺小细胞DTCs ， 另外一些EpCAM⁺小细胞异倍体CTCs经血流至远端器官，外渗穿透出血管，形成远端转移灶。本研究首次揭示了EpCAM⁺异倍体小细胞CTCs在肿瘤转移过程中的重要作用。

肿瘤转移模式图如下：

2. 乳腺癌病人CTCs 与DTCs中的EpCAM⁺细胞所占比例与患者的肿瘤远端定向肺转移(oligometastasis) 及不良预后密切相关。其中EpCAM⁺ DTCs相关性更大，骨髓中EpCAM⁺ DTCs 在DTCs总数中所占比例≥20%， 患者总生存率显著下降。

3. 临床常规、无创检测血液中EpCAM 蛋白阳性表达的异倍体小细胞CTCs，可有效评估、判断乳腺癌患者的肿瘤远端转移，而EpCAM⁺二倍体CTCs则与肿瘤转移无明显相关性。

4. 依赖EpCAM表达的阳性捕获法会丢失所有EpCAM^- CTCs (如与药敏或耐药相关的CTCs等)，但有可能分离出与转移相关的EpCAM⁺ CTCs，前提是这些细胞的染色体必须为异倍体。本研究结果同时提示，应用“细胞筛”过滤法会显著丢失具有远端转移能力的小细胞CTCs与DTCs。

应用赛特SE-iFISH技术（www.cytointelligen.com）可对外周血CTC、骨髓DTC等体液中脱落肿瘤细胞的染色体倍体及各种肿瘤标志物蛋白进行持续的同步原位动态监测，从而锁定与肿瘤转移相关的各种亚类细胞，并结合后续单细胞测序，可对肿瘤侵袭、转移过程中的作用机制进行深入研究，从而为进一步改进、优化肿瘤的诊断方法和治疗手段提供有力支持。