【新手福利】qPCR分析外泌体RNA如何选参照

2019 年 11 月 8 日 外泌体之家

外泌体RNA如何进行qPCR定量,这是目前大家都纠结的问题。 主要的难点在于如何对结果进行均一化处理(通俗讲,内参的选择 或外参的使用策略)。 对于这个问题我们先看一下Journal of Extracellular Vesicles上的几篇文章是怎么处理的。

J Extracell Vesicles . 2019; 8(1): 1629865

这篇文章选取的方式是使用外参,即每个样品加入5 fmol/uL的cel-miR-39,最后通过外参对数据进行归一化处理。具体方法我们稍后讨论。


J Extracell Vesicles. 2019; 8(1): 1670935.

这篇文章选取的方式是寻找两个可以作为内参的miRNA,然后通过两个内部参照miRNA对样品进行均一化处理。
 
J Extracell Vesicles . 2017; 6(1): 1401897

这篇文章选取的方式是使用了合成的突变型let-7-as,最后通过突变型let-7-as对数据进行归一化处理。其实这里就是将let-7-as作为一种外参使用而已。
 
J Extracell Vesicles. 2019; 8(1): 1643670

这篇文章选取的方式是使用外参同时结合样品起始体积,最后通过其实体积进行均一化处理,利用外参校准样品间RNA抽提效率的差异。其实和第一篇的方法一样,只是在这里描述的更清晰而已。

由此可见,目前在JEV这样的囊泡领域专业期刊中,外参结合样品起始体积的均一化策略是比较符合大众想法,接受度比较高的。
1. 关于外参。 外参其实仅仅是一个外部参照。选取时,需要避开自己所研究物种相关的RNA,线虫的miR-39用的比较多,比较成熟了,所以大家都用它。但如果你是研究线虫的,那这个外参就不适合你了。如果有同学想另辟蹊径,选个其它的外参也行,如果选了不常用的外参,那你要证明你的外参引物和你关注物种内的其他序列没有明显的相似区域。所以,不想让审稿人攻击你,就老老实实的用常见外参。关于外参选择就说这么多。
2. 关于外参的使用原理。 其实外参就是样品中另外加进去的东西。更多的时候外参用来衡量你抽提RNA的效率。例如,你A和B样品都加了1万个外参分子。抽提RNA后检测显示A样品中有6000个  B里面4000个。那就说明A样品RNA提取效率60%  B 40%(仅示例,不代表真实回收率)。如果你在加入外参前不考虑A B样品在量上的差异, 那么外参仅能用于计算回收效率。
3. 关于EV中外参定量的策略原理。 一般来说,使用外参来进行EV RNA分析,有一个前提,即你要在相同量的不同样品中加入等量的外参。例如还是A和B样品,A样品起始是1亿个囊泡,B样品是2亿个囊泡(换成蛋白量也是一个意思)。那么,A中加入1万外参,B中应该对应加入2万,这样才方便计算(你要另辟蹊径,随缘加入也行,就是后面需要你慢慢折算)。抽提后,直接通过外参定量,这样你可以去除上样量差异的影响,同时可以去除抽提RNA时的效率差异的影响。思考一下为什么?其实很简单的道理,我们平时检测细胞中的U6作为内参,其背后的逻辑就是相同量的细胞中包含的U6是相同量的。这里只是通过将外参锚定到样品量,在样品中人为的搞了个“人造U6”而已。
4. 我们的具体操作策略。 其实对于JEV这种专业刊物来说,方法学的准确性有的时候甚至高过文章的新颖程度和生物学结论的意义大小。所以,JEV对于检测外泌体中miRNA的实验策略要求肯定很严格。但是如果你去关注一下其他十几分的杂志,也是有不少文章没有使用外参的,直接通过起始样品体积、囊泡蛋白量或者抽提出来RNA的量进行均一化。如果不加外参,我们也可以直接用上述方法进行均一化。例如, A样品起始100ug EV,B样品 起始200ugEV。抽提RNA,所有RNA逆转录后用于qPCR。基因1,在A中表达CT值为20, B中为19。那么A B中基因1 表达大致相等。也可以用RNA量作为均一化的参照。例如 都取100ng RNA, qPCR后 A样品CT 20, B CT 19,那说明B是A中的2倍。

外参加多少?
一般控制在10e^7~10e^9个分子/样品就好(参考外泌体群友的建议)。一般来说就是5fmol/ul的外参,一个样品加1ul就好。不要太纠结,毕竟qPCR非常灵敏。哪怕你外参少加了一百倍,外参的Ct值也不过是增加7而已。
另外举个栗子,如果我们直接用外泌体蛋白量进行均一化,如何进行计算。正常的操作中2^(-△△Ct)中的-△△Ct就等于内参CT值减去目的基因CT值。所以这里你只需要用蛋白量替代内参CT值即可,又由于不同样品的起始蛋白量一致,所以这个CT值没有任何意义,你假设CT值是0或者是40是等效的。所以,为了计算简便,直接将CT值设为0就好。最后你会发现,你样品中基因的表达量直接可以表示为2^(-CT)。这种方法定量比较粗糙,没有考虑不同样品间RNA抽提效率的问题。这里你也可以将蛋白量更改为利用RNA量进行均一化,这样也就不存在抽提效率差异带来的变化了。

关于qPCR分析外泌体RNA的均一化策略问题,就先谈这么多。大家可以消化一下。另外,大家如果针对均一化问题还有疑惑的话可以留言,我会视留言情况规划进一步的讲解。

O(* ̄— ̄*)o 让我们沐浴春风,收获paper~ 大家加油~

往期新手福利系列↓↓

【新手福利】外泌体领域新手常见问题(一)

【新手福利】外泌体领域新手常见问题(二)

【新手必读】外泌体研究大汇总

【新手福利】初识外泌体  二

【新手福利】初识 外泌体 三

【新手福利】初识外泌体(四)—— 国内的朋友都用什么方法分离外泌体

【新手福利】初识 外泌体 五

【新手福利】初识外泌体(六)

【新手福利】如何使用trizol抽提细胞外囊泡中RNA

【新手福利】初识 外泌体 七

【新手福利】MISEV2018解读(一) 

【新手福利】MISEV 2018解读(二)

【新手福利】MISEV 2018解读(三)

【新手福利】MISEV2018解读(四)
【新手福利】MISEV2018解读(五)
【新手福利】MISEV2018解读(六)

【科研成长加油站】
临床科研设计与数据管理(11/12-14 上海)
肠道菌群与与代谢组学国自然课题设计及研究策略专题会议(11/16-17 西安)
万用模版SCI英文论文写作法学习会 (11/22-24 上海)
系统评价与Meta分析实战速成班(2019/11/23-24 北京)
不做实验不写meta,轻轻松松发40多篇SCI(11/23-24 北京)
四天学会Nature级的图表及插图制作方法(11/28-12/01上海)
零基础用R语言挖掘科研数据发表高分文章(11/23-24 北京; 12/14-15 上海 )
2020年国自然基金标书构思及撰写经验分享会(12/7-8上海)
临床医师零基础基于R语言挖掘SEER等公开肿瘤数据库(12/7-8 上海)
买本书学习一下--细胞外囊泡进步的阶梯
回复“外泌体” 阅读外泌体最新科研进展及动态
回复“EV 阅读 2016-2018年This Week in Extracellular Vesicles
回复“盘点” 阅读 外泌体领域十大前沿进展盘点
登录查看更多
2+

相关内容

【导读】一些独特的医学成像视角,如前沿的成像方法、数据分析、与神经认知功能更好的相关性,以及疾病监测的详细示例和总结,可能有助于传达医学成像原理和应用的方法学、技术和发展信息。这本书的目的是为初学者和医学成像领域的专家提供一般的图像和详细的描述成像原理和临床应用。具有最前沿的应用和最新的分析方法,这本书将有望获取医疗成像研究领域的同事的兴趣。精确的插图和彻底的审查,在许多研究课题,如神经成像定量和相关性,以及癌症诊断,是这本书的优势。

  1. 结构和功能连接的纵向变化以及与神经认知指标的相关性 (Longitudinal Changes of Structural and Functional Connectivity and Correlations with Neurocognitive Metrics)By Yongxia Zhou

考虑到许多与年龄相关的风险,包括血管和神经炎症的增加,以及可能混淆基准功能磁共振参数图像,在相对较短的时间内揭示个体水平上的脑功能和微观结构变化尤其重要。细胞水平的轴索损伤和/或脱髓鞘以及弥散的中观水平物质异常聚集和结构/功能异常可在短的亚急性/急性期发生,而与年龄纵向变化相关的文献仅局限于我们以前的fMRI发现。纵向数据用来描述这些多参数,包括随机截距和个体间隔。性别交互作用对DTI分数各向异性(FA)和扩散系数均无显著影响。区间有效区域表现出FA的纵向变化,径向扩散系数(RD)/轴向扩散系数(AX)值与截面数据的老化结果相似。在DTI和fMRI指标之间,以及成像和神经认知数据(包括速度和记忆力)之间,发现了显著的相关性。我们的结果表明,年龄、性别和载脂蛋白E (APOE)基因型对结构和功能连接在短间隔和横断面范围内的显著和一致的影响,以及相关的神经认知功能。

https://www.intechopen.com/books/medical-imaging-principles-and-applications/longitudinal-changes-of-structural-and-functional-connectivity-and-correlations-with-neurocognitive-

  1. 功能磁共振成像在神经性疼痛中的应用 The Application of Functional Magnetic Resonance Imaging in Neuropathic Pain By Zhi Dou and Liqiang Yang

在过去,神经性疼痛一直缺乏理想的影像学研究方法,这不仅限制了我们对神经性疼痛发病机制的研究,而且严重影响了治疗的预后。近年来,随着fMRI技术的飞速发展,越来越多的学者开始将fMRI技术应用于神经性疼痛的研究。这为揭示神经性疼痛的内在机制和改进临床治疗理念提供了新的思路。在这一章中,我们对fMRI在神经性疼痛中的最新研究进行了综述,以便读者更好的了解研究现状和未来的研究方向。

https://www.intechopen.com/books/medical-imaging-principles-and-applications/the-application-of-functional-magnetic-resonance-imaging-in-neuropathic-pain

  1. 电离辐射与物质的相互作用,x射线计算机断层成像,核医学SPECT, PET和PET- ct断层成像 The Ionizing Radiation Interaction with Matter, the X-ray Computed Tomography Imaging, the Nuclear Medicine SPECT, PET and PET-CT Tomography Imaging By Evangelos Gazis

描述了重带电粒子、电子和光子与物质的电离辐射相互作用的机理。这些影响造成能量损失的辐射与吸收或衰减的顺序效应提出。介绍了几种具有相关电子学和数据采集系统(DAQ)的特征检测系统的特点。这些探测器与医学成像传感器系统有关。介绍了单光子计算机断层扫描(SPECT)、正子断层扫描(PET)和PET- ct联合成像在医学成像过程中的特点。计算机x射线断层摄影,称为CT,和核医学断层摄影被提出,实现了大部分以前的部分,因为他们被定义为PET和SPECT成像加上PET与CT的结合PET-CT。

https://www.intechopen.com/books/medical-imaging-principles-and-applications/the-ionizing-radiation-interaction-with-matter-the-x-ray-computed-tomography-imaging-the-nuclear-med

  1. PET-CT的原理及其在肺癌治疗中的应用 PET-CT Principles and Applications in Lung Cancer Management By Long Chen, Hua Sun and Yunchao Huang

肺癌是世界上最常见的恶性肿瘤;正电子发射断层扫描(PET-CT)结合了来自PET的新陈代谢信息和来自CT的解剖学细节,这是目前最先进的技术。本文介绍了PET-CT及其在肺癌诊断、分期和治疗中的应用。从肺癌的临床特点、分型、分级、病理、PET-CT的原则、诊断和治疗的评价等方面进行了综述。详细说明了每种癌症亚型、分期标准和分类。内容将有利于临床医生以及放射科医生。

https://www.intechopen.com/books/medical-imaging-principles-and-applications/pet-ct-principles-and-applications-in-lung-cancer-management

  1. 医学影像处理技术的研究 Research in Medical Imaging Using Image Processing Techniques By Yousif Mohamed Y. Abdallah and Tariq Alqahtani

医学成像是为了识别或研究疾病而获取身体部位的医学图像的过程。全世界每周都有数百万的成像过程。由于图像处理技术的发展,包括图像识别、分析和增强,医学影像正在迅速发展。图像处理增加了检测组织的百分比和数量。本章介绍了简单和复杂的图像分析技术在医学成像领域的应用。本章还总结了如何使用不同的图像处理算法(如k-means、基于roi的分割和分水岭技术)来举例说明图像解释的挑战。

https://www.intechopen.com/books/medical-imaging-principles-and-applications/research-in-medical-imaging-using-image-processing-techniques

成为VIP会员查看完整内容
38+
0+
Top