【新手福利】qPCR分析外泌体RNA如何选参照

11 月 8 日 外泌体之家

外泌体RNA如何进行qPCR定量,这是目前大家都纠结的问题。 主要的难点在于如何对结果进行均一化处理(通俗讲,内参的选择 或外参的使用策略)。 对于这个问题我们先看一下Journal of Extracellular Vesicles上的几篇文章是怎么处理的。

J Extracell Vesicles . 2019; 8(1): 1629865

这篇文章选取的方式是使用外参,即每个样品加入5 fmol/uL的cel-miR-39,最后通过外参对数据进行归一化处理。具体方法我们稍后讨论。


J Extracell Vesicles. 2019; 8(1): 1670935.

这篇文章选取的方式是寻找两个可以作为内参的miRNA,然后通过两个内部参照miRNA对样品进行均一化处理。
 
J Extracell Vesicles . 2017; 6(1): 1401897

这篇文章选取的方式是使用了合成的突变型let-7-as,最后通过突变型let-7-as对数据进行归一化处理。其实这里就是将let-7-as作为一种外参使用而已。
 
J Extracell Vesicles. 2019; 8(1): 1643670

这篇文章选取的方式是使用外参同时结合样品起始体积,最后通过其实体积进行均一化处理,利用外参校准样品间RNA抽提效率的差异。其实和第一篇的方法一样,只是在这里描述的更清晰而已。

由此可见,目前在JEV这样的囊泡领域专业期刊中,外参结合样品起始体积的均一化策略是比较符合大众想法,接受度比较高的。
1. 关于外参。 外参其实仅仅是一个外部参照。选取时,需要避开自己所研究物种相关的RNA,线虫的miR-39用的比较多,比较成熟了,所以大家都用它。但如果你是研究线虫的,那这个外参就不适合你了。如果有同学想另辟蹊径,选个其它的外参也行,如果选了不常用的外参,那你要证明你的外参引物和你关注物种内的其他序列没有明显的相似区域。所以,不想让审稿人攻击你,就老老实实的用常见外参。关于外参选择就说这么多。
2. 关于外参的使用原理。 其实外参就是样品中另外加进去的东西。更多的时候外参用来衡量你抽提RNA的效率。例如,你A和B样品都加了1万个外参分子。抽提RNA后检测显示A样品中有6000个  B里面4000个。那就说明A样品RNA提取效率60%  B 40%(仅示例,不代表真实回收率)。如果你在加入外参前不考虑A B样品在量上的差异, 那么外参仅能用于计算回收效率。
3. 关于EV中外参定量的策略原理。 一般来说,使用外参来进行EV RNA分析,有一个前提,即你要在相同量的不同样品中加入等量的外参。例如还是A和B样品,A样品起始是1亿个囊泡,B样品是2亿个囊泡(换成蛋白量也是一个意思)。那么,A中加入1万外参,B中应该对应加入2万,这样才方便计算(你要另辟蹊径,随缘加入也行,就是后面需要你慢慢折算)。抽提后,直接通过外参定量,这样你可以去除上样量差异的影响,同时可以去除抽提RNA时的效率差异的影响。思考一下为什么?其实很简单的道理,我们平时检测细胞中的U6作为内参,其背后的逻辑就是相同量的细胞中包含的U6是相同量的。这里只是通过将外参锚定到样品量,在样品中人为的搞了个“人造U6”而已。
4. 我们的具体操作策略。 其实对于JEV这种专业刊物来说,方法学的准确性有的时候甚至高过文章的新颖程度和生物学结论的意义大小。所以,JEV对于检测外泌体中miRNA的实验策略要求肯定很严格。但是如果你去关注一下其他十几分的杂志,也是有不少文章没有使用外参的,直接通过起始样品体积、囊泡蛋白量或者抽提出来RNA的量进行均一化。如果不加外参,我们也可以直接用上述方法进行均一化。例如, A样品起始100ug EV,B样品 起始200ugEV。抽提RNA,所有RNA逆转录后用于qPCR。基因1,在A中表达CT值为20, B中为19。那么A B中基因1 表达大致相等。也可以用RNA量作为均一化的参照。例如 都取100ng RNA, qPCR后 A样品CT 20, B CT 19,那说明B是A中的2倍。

外参加多少?
一般控制在10e^7~10e^9个分子/样品就好(参考外泌体群友的建议)。一般来说就是5fmol/ul的外参,一个样品加1ul就好。不要太纠结,毕竟qPCR非常灵敏。哪怕你外参少加了一百倍,外参的Ct值也不过是增加7而已。
另外举个栗子,如果我们直接用外泌体蛋白量进行均一化,如何进行计算。正常的操作中2^(-△△Ct)中的-△△Ct就等于内参CT值减去目的基因CT值。所以这里你只需要用蛋白量替代内参CT值即可,又由于不同样品的起始蛋白量一致,所以这个CT值没有任何意义,你假设CT值是0或者是40是等效的。所以,为了计算简便,直接将CT值设为0就好。最后你会发现,你样品中基因的表达量直接可以表示为2^(-CT)。这种方法定量比较粗糙,没有考虑不同样品间RNA抽提效率的问题。这里你也可以将蛋白量更改为利用RNA量进行均一化,这样也就不存在抽提效率差异带来的变化了。

关于qPCR分析外泌体RNA的均一化策略问题,就先谈这么多。大家可以消化一下。另外,大家如果针对均一化问题还有疑惑的话可以留言,我会视留言情况规划进一步的讲解。

O(* ̄— ̄*)o 让我们沐浴春风,收获paper~ 大家加油~

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